③蛋白酶的剂量 可溶性一般转用的剂量为0.1%-0.25%（生命力1:200或1:250），但遇到难消化道的两的组织时，剂量可相应增加，消化道星期相应延长。剂量高对肝细胞有口服，而更高剂量的可溶性在养成混合物里可促进肝细胞的转化，若养成混合物里重新加入肝细胞，其少量可溶性可被肝细胞里抗可溶性遗传基因物质所清洗。
④高特为 一般确信可溶性在56℃时活性最强，但由于对肝细胞有破坏而不能被转用，不常采用的高特为为37℃，通不常在37℃同步进行消化道比常压依赖性作用慢速。
⑤pH pH8~pH9是可溶性生命力适合范围，但随碱性的减小其生命力也自此减小，活性强大部分慢速，肝细胞也格外易被消化道下来，消化道复合肝细胞时PH只能选用7.6~8.0错综复杂，否则对肝细胞有损伤。
⑥无机盐原子 若用所包涵铁质和氧的盐类溶混合物来化学合成可溶性时，可以起因依赖性糖原蛋白的消化道依赖性作用。因此，在化学合成时应转用无铁质氧原子的PBS化学合成。
⑦消化道星期 如果肝细胞消化道星期过长，可以破坏肝细胞的呼出气蛋白酶，从而不良影响肝细胞的代谢，一般消化道星期为20分钟为宜，冷水消化道时采用低剂量消化道混合物，于4℃半夜也可。
复合原理则如下：
①半夜冷水消化道 将获得的两的组织用Hanks混合物洗三次，剪已成碎块尺寸为4毫米大概，用Hanks混合物洗2~3次以转化已成血球和脂肪两的组织，先重新加入0.25%的可溶性，摇匀后放4℃半夜，当晚先用Hanks混合物浇，弃去上清，共洗2~3次，然后，重新加入少量营养混合物吹打大部分，肝细胞除此以外，按相应的剂量分瓶养成。
②多次复合出消化道法则 多次复合出消化道法则有此列于三种：
微消化道多次复合出---将剪碎的肝细胞块重新加入0.25%可溶性37℃水浴里消化道15~20分钟，然后经浇还用营养混合物大部分制品肝细胞悬混合物，按合适的剂量分瓶养成，然后将遗留下的仍未从根本上消化道的两的组织按上述原理则加载，先消化道复合出肝细胞。
冷水消化道多次复合出---原理则同上，只是消化道高特为为4℃。
先微消化道后冷水消化道---将两的组织块先用可溶性于37℃下消化道20分钟经浇还用营养混合物大部分，制品悬混合物，悉数仍未消化道的小两的组织块经浇还用糖原蛋白酶于4℃下半夜，当晚先复合出肝细胞，大部分已成悬混合物，分瓶养成。
（2） 胶原蛋白酶（Collagenase）消化道法则
胶原蛋白酶是一种从微微生物里复合出出来的蛋白酶，对胶原有很强的消化道依赖性作用。适于消化道拉伸性两的组织、上皮两的组织以及癌两的组织，它对肝细胞间质有较好的消化道依赖性作用，对肝细胞本身不良影响不小，可使肝细胞与胶原已成分重归而不受伤害。该蛋白酶复合效果好，即使有铁质、氧原子假定仍有活性，故最简单PBS和包涵肝细胞的养成混合物化学合成，即加载简单又可增加肝细胞已成活率，最终剂量200u/mL或0.1~0.3mg/mL.此蛋白酶消化道依赖性作用缓解，须要机械衰减，但胶原蛋白酶商品价格较高，大量采用将减小实验室已成本。
经过胶原蛋白酶消化道后的上皮两的组织，由于上皮肝细胞对蛋白酶有耐受性，可能有一些上皮肝细胞球状尚为仍未被基本上消化道先于。已成小球状的上皮肝细胞比大部分的单个上皮肝细胞格外易发育，因此不必要先进一步消化道解决问题。
鉴于可溶性和胶原蛋白酶的生一物学活性（见列于4-1）和在有所不同剂量下消化道各种两的组织小块所才可的星期（全程）有关联性（见列于4-2），以及两者商品价格差不多，有人转用胶原蛋白酶与可溶性并用，同时还一般而言透明质酸蛋白酶（对肝细胞列于面糖基有依赖性作用），转用两者的合组消化道依赖性作用，对大部分啮齿类动物和兔肝、癌两的组织非不常理论上。
列于4-1 可溶性和胶原蛋白酶生一物活性的相异
项 目可溶性胶原蛋白酶消化道功能性适使用消化道软两的组织适使用消化道拉伸多的两的组织用 量0.01%~0.5%0.1~0.3mg/mL（200u/mL）消化道星期 0.5~2全程（小块）1~12全程pH 8~96.5~7.0依赖性作用强度强烈缓解肝细胞不良影响星期过长有不良影响无大不良影响肝细胞、铁质、氧原子有不良影响无不良影响列于4-2 可溶性和胶原蛋白酶在有所不同高特为下消化道各种两的组织小块时所才可星期（全程）（0.5~1cm3）
蛋白酶 种 类 较 粗大 两组 织软 两组 织4℃ 室 特为 37℃ 4℃ 室 特为 37℃可溶性（0.25%）24~481~61~212~24 1~20.5~1胶原蛋白酶（200u/mL） 2466.51230.25两者合组（套利）12~4612~244~1212~246~121~2除上述两种最不常用的消化道蛋白酶部份，还有链霉丝氨酸、疙瘩丝氨酸、鲎蛋白酶、弹性丝氨酸、木瓜丝氨酸，近年来，还有一种从白霉菌里复合出的Pronase新蛋白酶大部分肝细胞格外佳。
2、非蛋白酶消化道法则（EDTA消化道法则）
EDTA是一种非蛋白酶消化道一物，又称甘油或Versene,全名为乙烯磺酸四苯酚。不常用不包涵铁质、氧原子的PBS配已成0.02%的工作混合物，对一些两的组织，尤其是上皮两的组织大部分效果好，该化学一物质能与肝细胞上的铁质、氧原子联结形已成螯合一物，利用联结后的机械力使肝细胞变圆而大部分肝细胞或使贴壁肝细胞从瓶东南侧重归，缺点是肝细胞易氢化或贴壁肝细胞从瓶东南侧重归时黄绿色片状，有球状，不常不基本上采用，但可与可溶性混合采用（1:1或2:1），不仅不利于肝细胞脱壁又不利于肝细胞大部分，可减小糖原蛋白酶的添加剂和口服依赖性作用。
消化道复合法则的加载步骤：
（1）剪切 把两的组织块剪碎，黄绿色1~5mm3尺寸的两的组织块。
（2） 加混合物漂洗 将碎两的组织块在平皿（或三角烧瓶）里用无铁质氧PBS洗2-3次（转用弯曲，自然现象堆积法则）。
（3）消化道 重新加入消化道混合物（可溶性或胶原蛋白酶或EDTA）于37℃水浴里依赖性作用相应星期（里间可轻摇1~2次），若两的组织块膨松黄绿色絮状可终止，若变化不小可格外换一次消化道混合物，暂时消化道才于膨松絮状为止。可溶性消化道星期不宜过长。
（4）弃去消化道混合物 转用弯曲自然现象堆积或加速离心法则尽力弃去消化道混合物。
（5）漂洗 将所包涵铁质、氧原子的养成基沿瓶壁缓缓重新加入，里止消化道质子化，转用漂洗法则洗2-3次后，重新加入基本上养成基。
（6）机械大部分 转用出气管吹打或衰减法则，使肝细胞充大部分先于还用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶养成，若要求不高可转用弯曲自然现象堆积5~10分钟，出气上层肝细胞悬混合物同步进行分瓶养成。
注意事项如下：
（1）两的组织块才可漂洗2-3次以转化已成两的组织里的铁质、氧原子和肝细胞对可溶性和EDTA的依赖性依赖性作用。
（2）糖原蛋白剂量不宜过高，依赖性作用星期不能毕竟长，以尽量避免口服依赖性作用。
（3）消化道后两的组织不仅要尽力弃去消化道混合物，以尽量避免口服产生，而且动作要轻，以尽量避免膨松的肝细胞随漂洗而被窃。
三、原代肝细胞的养成原理则
原代肝细胞的养成也叫初代养成 便是小分子获得两的组织肝细胞在体部份同步进行的首次养成，是建立肝细胞系的第一步，是一项基本技术。原代肝细胞因刚从两的组织里复合先于，生一物学功能性仍未起因更大变化，仍延续原来的遗传基因功能性，也最接近和反映体内发育功能性，适合使用药一物持续性试验性、肝线粒体等实验室研究成果。
原代肝细胞往往有多种肝细胞两分已成，比较混杂，即使从形体上为同一各种类型（上皮十分相似或已成拉伸十分相似），但肝细胞间仍有更大关联性。如果小分子有所不同，即使两的组织各种类型、部位相同，个体关联性也照十分相似假定，原代肝细胞生一物功能性尚为不牢固，如才可暂时做较为严格的对比性实验室研究成果，还才可同步进行短期传代养成。
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